c-Abl在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其恶性行为作用机制的初步探讨

【摘要】女性生殖器官最常见三大恶性肿瘤包括子宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢恶性肿瘤，发病率均呈逐年上升趋势。卵巢恶性肿瘤的发病率位居前两位之后，但其死亡率却高居第一。由病理学检查确诊，卵巢恶性肿瘤中约有85%～90%为卵巢恶性上皮性肿瘤。上皮性卵巢癌（Epithelialovariancancer,EOC）死亡率高主要原因有以下几点：1）卵巢隐匿于盆腔深部，检查时不易及时发现病变卵巢；2）绝大多数EOC患者早期无明显症状和体征，不易发现，确诊时有75%以上的患者疾病已经进展到肿瘤中晚期（FIGOIII～IV期）；3）EOC在肿瘤早期时就具有盆腹腔播散转移的特性，且术后极易复发；4）EOC患者对于铂类、紫杉醇等一线化疗药物易产生耐药。近几年，临床上即使采取了肿瘤细胞减灭术加联合药物化疗等综合治疗手段，同时改进了术中方法和增加新的靶向治疗方案，但对于EOC患者来说，并未有效地改善其预后。根据文献资料表明，EOC患者的5年生存率始终徘徊在30%左右。据报道，世界上每年有近204,000名的新发病例，约125,000名女性不幸死于卵巢癌，对广大妇女的家庭生活和健康造成严重威胁。目前，对于EOC的发病机制尚未阐明。侵袭和转移是导致卵巢癌治疗失败和患者死亡的主要原因，因此探讨卵巢癌的恶性生物学行为及其发生的分子生物学基础一直是妇科肿瘤研究领域中的热点。恶性肿瘤的发生发展及转移是一种复杂的恶性生物学行为，癌细胞先在原发病变区域增殖，继而向周围邻近组织浸润并使其发生破坏，然后脱离原发病灶，经血道及淋巴道转移，在远处器官形成单个或多个转移瘤。在这一系列过程中，关键环节在于癌细胞向周围正常组织的浸润侵袭，而启动这一步骤依赖于癌细胞的极化运动能力。癌细胞的侵袭过程，主要是通过调节细胞肌动蛋白的聚合及解聚提供的动力，使癌细胞伪足得到支持能够维持延伸而发生迁移。致力于探究肌动蛋白如何在肿瘤细胞侵袭伪足部位聚合，如何调节各肌动蛋白之间的协作，也许可以达到控制癌细胞侵袭的目的。本课题组前期在“吸烟与粘液性卵巢癌的发病相关性”以及“上皮性卵巢癌早期诊断研究”中采用反向捕获抗体芯片，发现卵巢癌患者血清中均存在WAVE1（Wiskott-Aldrichsyndromeproteinfamilyverprolin-homologousprotein1,WAVE1）蛋白升高，具有血清差异性表达意义，提示其可能是EOC的一个标志蛋白。通过课题组成员前期研究发现，WAVE1作为一种新型肌动蛋白调节蛋白，在EOC的增殖及侵袭转移等恶性行为中发挥着重要的作用，同时研究发现ABL酪氨酸激酶参与WAVE1介导的肌动蛋白骨架重排过程。c-Abl酪氨酸激酶属于非受体Abelson酪氨酸激酶超家族中的一员，由于在其羧基端具有F-actin、G-actin结构域。在一定的条件下，c-Abl激酶可以直接同纤维性和球形肌动蛋白相结合，在细胞骨架重排和细胞伪足（如丝状伪足、侵袭性伪足）聚集形成过程中扮演着重要角色。研究发现，在乳腺癌、慢性髓性白血病、恶性黑色素瘤、胃肠道间质恶性肿瘤等肿瘤中，c-Abl均呈高表达，提示c-Abl可能在肿瘤侵袭转移过程中扮演着重要的角色。伊马替尼（imatinib/STI571）是一类非受体酪氨酸激酶特异性小分子抑制剂，具有c-Abl、c-kit及PDGFR等多个有效靶点。最早用于慢性髓性白血病的治疗，并获得了令人满意的临床效果。在前列腺癌、大肠癌、胃癌等恶性实体肿瘤中伊马替尼的治疗作用也得到肯定。近年来，国外有学者进行关于伊马替尼类酪氨酸激酶抑制剂在治疗复发性卵巢癌、难治性卵巢癌及对铂类和紫杉醇耐药的卵巢癌治疗效果的临床药理实验。研究发现，对于存在酪氨酸激酶表达的卵巢癌患者，伊马替尼也许能获得一定的临床受益。但目前对于c-Abl在EOC中的相关基础研究较少。因此，本课题将从以下四个部分对c-Abl在EOC发生发展及侵袭行为中的作用进行研究，以期探讨c-Abl在EOC恶性生物学行为中可能涉及的分子机制，为非受体酪氨酸激酶抑制剂治疗卵巢癌的临床可行性补充理论依据。第一部分c-Abl在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其临床意义目的检测在不同EOC标本中c-Abl蛋白表达情况，探讨c-Abl的表达与EOC患者临床病理特征之间的关联性。方法（1）采用免疫组织化学测定22例正常卵巢组织，28例良性卵巢肿瘤组织，18例交界性卵巢肿瘤组织及137例EOC组织标本中c-Abl的表达情况，分析c-Abl的异常表达与其临床病理特征的相关性。（2）采用Westernblot测定18例正常卵巢组织标本，17例卵巢良性肿瘤组织标本，14例卵巢交界性肿瘤组织标本和32例EOC组织标本中c-Abl的表达情况，分析c-Abl的异常表达与其临床病理特征的相关性。（3）应用Kaplan-Meier生存分析比较不同EOC组织标本中c-Abl表达强弱对患者生存时间的影响；Cox回归分析研究关于EOC患者生存时间的相关影响因素。（4）采用Westernblot检测不同人卵巢癌细胞株（SKOV3、3AO、OVCAR-3、ES-2）中c-Abl蛋白表达情况，应用激光共聚焦显微镜技术探究c-Abl在人卵巢癌细胞株中的亚细胞定位。结果（1）免疫组化结果显示，在137例EOC组织标本中，c-Abl呈强阳性表达有94例（68.6%），低表达或不表达者有43例（31.4%）；在正常卵巢组织21例（95.5%）、卵巢良性肿瘤24例（85.7%）及卵巢交界性肿瘤14例（77.8%）呈c-Abl不表达，差异有显著统计意义（P＜0.05）。在EOC中，FIGO分期中III～IV期的c-Abl蛋白表达水平显著高于I～II期组织（P＜0.001），c-Abl表达水平在病理分化程度为中低分化显著高于高分化者（P＜0.001），c-Abl表达水平在EOC患者血浆Ca-125≥35U/ml的显著高于Ca-125＜35U/ml（P=0.019），c-Abl表达在术后残余肿瘤直径≥1cm的EOC患者显著高于术后残余肿瘤直径＜1cm者（P=0.015），但与EOC患者腹水情况、病灶单双侧、年龄、肿瘤大小及病理学类型无关（P＞0.05）。（2）Westernblot结果显示，EOC组织标本中c-Abl的表达显著高于正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织及卵巢交界性肿瘤组织(分别为：1.704±0.382，0.317±0.062，0.334±0.066，0.346±0.068)，差异有显著统计学意义（P＜0.05）。在EOC组织中，c-Abl蛋白表达水平与EOC组织分化程度、术后残余肿瘤直径大小、患者血浆Ca-125水平、FIGO肿瘤分期有关（P＜0.05），而与EOC患者腹水情况、病灶单双侧、年龄、肿瘤大小及病理学类型无关（P＞0.05）。（3）Kaplan-Meier生存分析显示，c-Abl高表达的EOC患者生存时间显著短于c-Abl低表达的患者（P＜0.05），多变量分析表明不满意的肿瘤细胞减灭术、c-Abl高表达和FIGO分期中晚期可能是EOC预后的独立因素。（4）c-Abl在SKOV3、3AO、ES-2、OVCAR-3中的表达分别为：1.044±0.138，0.905±0.096，0.943±0.170，0.855±0.750；通过激光共聚焦显微镜观察到c-Abl与肌动蛋白共表达于细胞膜和细胞质上。结论（1）c-Abl在不同EOC细胞和组织标本中呈高表达。高表达的c-Abl与EOC肿瘤分化、术后残余肿瘤直径大小、肿瘤分期及患者血浆Ca-125水平有关。（2）c-Abl的高表达与EOC侵袭及患者不良预后相关，提示c-Abl可能在EOC恶性行为中扮演着重要的角色。第二部分c-Abl基因shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染人卵巢癌细胞株的筛选目的采用RNAi（RNAinterference，RNAi）技术设计、构建c-Abl的shRNA（shorthairpinRNA，shRNA）慢病毒包装载体，鉴定、筛选稳定转染的人卵巢癌细胞株（SKOV3），以便为后续实验提供基础。方法（1）设计并化学合成四条含高效特异性靶向c-Abl基因的重组质粒和一条阴性对照。主要通过双酶切实验以及精确的测定DNA序列对其重组质粒进行鉴定。（2）将经序列测定验证正确的重组质粒进行慢病毒包装，将pMagic7.1转染到293T细胞经收集、提纯、最后测定病毒滴度。采用慢病毒载体转染法，将包装好的质粒转染至SKOV3中，不断培养并逐步建立稳定转染的细胞株。（3）采用Westernblot方法检测转染组、未转染组及阴性对照组细胞中c-Abl蛋白表达的变化；采用Real-timePCR测定上述三组细胞中mRNA表达量的变化，验证并获得c-Abl基因抑制效果最佳的稳转细胞株。结果（1）设计合成四条c-Abl特异性shRNA，经双酶切法及DNA序列测定结果显示，成功构建了c-Abl基因RNAi的慢病毒载体。（2）慢病毒载体介导的c-Abl-shRNA1、c-Abl-shRNA2、c-Abl-shRNA3、c-Abl-shRNA4和阴性对照成功转入SKOV3，采用嘌呤霉素进行筛选并获得稳定表达的SKOV3单克隆细胞株。（3）采用Westernblot和Real-timePCR检测和验证，获得c-Abl基因抑制效果最显著的SKOV3-Ri2细胞。结论成功构建了c-Abl基因的特异性重组质粒。利用慢病毒载体进行包装，成功筛选获得c-Abl基因抑制效果最佳的SKOV3，为进一步研究c-Abl在EOC中恶性生物学行为及其可能相关的分子机制奠定基础。第三部分慢病毒介导的c-Abl基因沉默对SKOV3细胞株恶性行为的影响目的探究干扰c-Abl基因后对卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖、粘附、生长及侵袭等恶性生物学行为的影响。方法（1）采用Transwell小室检测SKOV3细胞在c-Abl基因沉默前后其迁移和侵袭能力的改变。（2）采用细胞粘附实验研究SKOV3细胞在c-Abl基因沉默前后其粘附能力的改变。（3）采用MTT法测定SKOV3细胞在c-Abl基因沉默前后其增殖能力的改变。（4）采用软琼脂克隆形成实验观察SKOV3细胞在c-Abl基因沉默前后其细胞群体增殖能力、依赖性的改变。（5）采用裸鼠移植瘤实验观察SKOV3细胞在c-Abl基因沉默前后其成瘤能力的改变。结果（1）干扰c-Abl表达使EOC细胞侵袭能力受到明显抑制：Transwell小室迁移结果显示，干扰组SKOV3-Ri2穿过聚碳酸脂膜迁移细胞个数较正常对照组、阴性对照组均明显减少（P＜0.05）。Transwell小室侵袭结果显示，干扰组SKOV3-Ri2穿过Matrigel侵袭细胞个数较正常对照组、阴性对照组均明显减少（P＜0.05）。细胞粘附实验显示，干扰组SKOV3-Ri2的细胞间粘附能力较正常对照组、阴性对照组均显著下降（P＜0.05）。（2）干扰c-Abl表达使EOC细胞生长增殖能力受到明显抑制：MTT结果显示，SKOV3-Ri2组细胞在转染后1d、2d、3d、4d以及5d，呈现的细胞生长曲线较正常对照组、阴性对照组平缓，生长速度亦呈现减缓（P＜0.05）。软琼脂克隆形成实验显示，SKOV3-Ri2干扰组细胞生长速度较正常对照组、阴性对照组迟缓，形成克隆数目明显减少（P＜0.05）。（3）干扰c-Abl表达使裸鼠皮下成瘤能力受到明显抑制：干扰组SKOV3-Ri2形成的移植瘤较阴性对照组瘤体体积小，成瘤能力明显减弱，生长速度缓慢。结论细胞株SKOV3增殖和侵袭转移能力在c-Abl基因沉默后受到明显抑制，提示c-Abl可能在EOC的增殖和侵袭转移等恶性生物学行为中扮演着重要角色，进一步为临床上应用c-Abl抑制剂治疗EOC提供有力的基础实验支持。第四部分c-Abl在上皮性卵巢癌恶性行为中的分子机制研究目的探究c-Abl在上皮性卵巢癌侵袭转移及增殖恶性行为中可能涉及的分子机制。方法（1）采用HE染色观察不同裸鼠移植瘤中肿瘤细胞形态学变化。（2）采用免疫组织化学和Westernblot检测阴性对照组和干扰组裸鼠移植瘤中与侵袭转移、增殖相关蛋白E-cadherin、MMP-2、MMP-9、VEGF、cyclinD1的水平变化。（3）采用Westernblot检测SKOV3细胞中ERK1/2、p-ERK1/2；AKT、p-AKT；P38MAPK、p-P38MAPK蛋白水平的变化在c-Abl基因沉默前后。结果（1）HE染色结果显示，SKOV3-Ri2移植瘤肿瘤细胞排列较整齐，可见极性，而SKOV3-NC移植瘤肿瘤细胞失去极性，排列紊乱。（2）免疫组化和Westernblot结果显示，在SKOV3-Ri2组中MMP-2、cyclinD1、MMP-9、VEGF蛋白表达水平较SKOV3-NC组显著降低，但E-cadherin蛋白表达水平呈现上升（P＜0.05）。（3）Westernblot检测信号转导通路相关蛋白水平结果显示，相对于SKOV3-NC细胞，SKOV3-Ri2细胞中AKT、p-AKT和p-P38MAPK蛋白明显降低（P＜0.05）。而P38MAPK、ERK1/2及p-ERK1/2无明显变化（P＞0.05）。结论在EOC细胞中，上调的c-Abl可能通过介导PI3K/AKT、P38MAPK信号转导通路，激活其下游相关效应蛋白参与EOC的恶性行为。c-Abl可能是PI3K/AKT和P38MAPK信号通路中潜在的调节因子。
【作者】周碎央；
【导师】唐良萏；
【作者基本信息】重庆医科大学，妇产科学，2014，博士
【关键词】EOC；c-Abl；侵袭；转移；RNAi；shRNA；卵巢癌细胞株；慢病毒；SKOV3；增殖；信号转导通路；机制；

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